隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，人工配合飼料的使用量逐年增加，導致飼料資源日趨緊張。因此，傳統(tǒng)飼料資源的高效利用及新型飼料資源的開發(fā)就顯得尤為重要。為了解決上述問題，近年來，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)移到發(fā)酵飼料這個新型飼料資源上。發(fā)酵飼料是以配合飼料為發(fā)酵底物，選擇接種特定的微生物，人工控制溫度、水分、需氧量等條件，通過微生物自身繁殖和代謝來生產(chǎn)的富含高活性益生菌及其代謝產(chǎn)物的飼料。與傳統(tǒng)飼料相比，發(fā)酵飼料具有抗營養(yǎng)因子含量低、營養(yǎng)價值高、小分子蛋白和肽類含量高等優(yōu)點。目前，發(fā)酵飼料已用于凡納濱對蝦( Litopenaeus vannamei) 、黑鯛( Acanthopagrus schlegelii) 、斑點叉尾 ( Ictalurus punctatus) 、草魚( Ctenopharyngodon idellu) 等的研究。但相對而言，其在水產(chǎn)中的應(yīng)用研究尚較少，相關(guān)作用機制和效果還有待進一步探究。此外，不同發(fā)酵飼料由于使用的微生物菌株及發(fā)酵工藝不同，其應(yīng)用效果差異較大，較難獲得穩(wěn)定、一致的效果。
微生物發(fā)酵是發(fā)酵飼料加工過程中的一個重要環(huán)節(jié)，在此過程中往往會產(chǎn)生一定的酸類物質(zhì)。因此，過量使用發(fā)酵飼料往往會導致水產(chǎn)動物腸道 pH 值下降、肌肉中酸性物質(zhì)的沉積并對其造成應(yīng)激，進而其腸道損傷、肌肉品質(zhì)下降和免疫機能受損，最終影響動物的生長性能、抗病力和養(yǎng)殖效益。鑒于此，在評估發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用潛力時，考察其對動物腸道消化吸收功能、肌肉品質(zhì)及免疫機能的影響顯得尤為重要。
因此，為了對發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果進行科學評估，本試驗以我國重要經(jīng)濟魚類———鯉魚( Cyprinus carpio) 為研究對象，從生長性能、體組成、腸道消化酶活性、肌肉品質(zhì)及免疫機能等方面入手，探討了發(fā)酵飼料對鯉魚幼魚生長性能及生理功能的影響，以期為發(fā)酵飼料在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用和新型水產(chǎn)飼料資源的開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。
1 材料與方法
1．1 試驗設(shè)計與飼料組成
本試驗中所用的發(fā)酵飼料和益生菌由南京寶輝生物飼料有限公司提供，其他原料均由徐州正昌飼料有限公司提供。發(fā)酵飼料是以豆粕、菜粕、次粉、玉米等作為底物，由酵母菌、芽胞桿菌和乳酸菌作為發(fā)酵菌種，并采用好氧和厭氧方法進行發(fā)酵而成。其成分大致如下( 本文中“%”除特別注明外，均表示質(zhì)量分數(shù)) : 水分 42%、粗蛋白 18%、粗灰分 3%、粗脂肪 1．3%、粗纖維 6%。本試驗共配制 5 組試驗飼料: 基礎(chǔ)飼料( 對照組， G1) 以魚粉、豆粕、菜粕和棉粕為主要蛋白源，以麩皮和面粉為糖源，魚油和豆油等比例添加為脂肪源。G2 和 G3 組的飼料是在基礎(chǔ)飼料中添加 2．5%和 5% 的發(fā)酵飼料( 鮮樣) 。此外，設(shè)定 2 個替代組: 以 5% 與 10% 的發(fā)酵飼料( 鮮樣) 等蛋白替代對照組的菜粕，即 G4 和 G5 組。試驗飼料的配方及營養(yǎng)成分含量見表 1。將原料粉碎后過 60 目篩，然后與磷酸二氫鈣、預(yù)混料和食鹽等微量原料進行預(yù)混合，再將其加入其他粉碎原料中逐級充分混勻，加入油脂和適量水后用小型制粒機制成粒徑 2 mm 的顆粒飼料，室溫避光晾干后保存于－20 ℃ 冰箱冷藏備用。
1．2 試驗魚與養(yǎng)殖管理
養(yǎng)殖試驗在南京農(nóng)業(yè)大學浦口試驗基地的戶外網(wǎng)箱內(nèi)進行，試驗所用鯉魚由中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心提供。正式試驗開始前，將鯉魚暫養(yǎng)于網(wǎng)箱中，期間投喂商品飼料使其適應(yīng)試驗環(huán)境。馴化 1 周后，將 300 尾體格健壯、規(guī)格整齊、初始體質(zhì)量為( 25．23±0．06) g 的鯉魚隨機分成 5 組，每組 4 個重復，每個重復 15 尾魚，置于一個網(wǎng)箱中。養(yǎng)殖試驗的 20 個網(wǎng)箱( 規(guī)格為 1．0 m×1．0 m×1．5 m) 在同一池塘中進行，養(yǎng)殖期為 10 周。每組飼喂 1 種飼料，每日定時飽食投喂 3 次( 07: 00、11: 30 和 16: 00) ，每日觀察并記錄魚攝食及死亡情況。試驗期間水溫 25 ～ 35 ℃ ， pH 值為 7．0 ～ 7．5，溶解氧含量大于 5．0 mg·L－1，氨氮含量小于 0．01 mg·L－1。
1．3 樣品采集與分析測定
1．3．1 樣品采集
養(yǎng)殖試驗結(jié)束后將魚饑餓 24 h，以排空其腸道內(nèi)容物，然后，從每個網(wǎng)箱隨機選取 4 尾魚，用 100 mg·L－1間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽( MS－222，美國 Sigma 公司) 進行麻醉處理。將魚置于冰袋上，用經(jīng)肝素鈉抗凝處理的醫(yī)用注射器從尾靜脈采血，血樣置于 2 mL 的抗凝管中，于 4 ℃、3 000 r·min－1離心 10 min。將血漿樣品置于－40 ℃ 冰箱中保存，用于血漿生化指標的測定。然后，將魚迅速解剖，逐級分離出肝臟、腹脂和腸道并稱質(zhì)量。將上述樣品用 4 ℃ 預(yù)冷后的生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干表面水分，并快速置于－40 ℃ 冰箱中冷凍保存，用于后續(xù)測定工作。內(nèi)臟采集完畢后，用手術(shù)刀剝開背部皮膚，切取 2 塊肌肉放入密封袋中，快速置于－40 ℃ 冰箱中冷凍保存，用于肌肉品質(zhì)的測定。此外，每組保留 2 尾全魚，置于－40 ℃ 冰箱中冷凍保存，用于體組成的測定。
1．3．2 飼料和魚體組成含量測定
將飼料和魚體稱質(zhì)量后置于培養(yǎng)皿中，在 105 ℃ 的烘箱中烘至恒質(zhì)量后計算得到水分含量; 粗蛋白( N×6．25) 含量采用全自動凱氏定氮儀( FOSS KT260，瑞士 FOSS 公司) 測定;粗脂肪含量采用索氏抽提儀測定; 粗灰分采用高溫灼燒法測定; 總能采用氧彈測熱儀( Parr 1281，美國PARR 公司) 測定。
1．3．3 肉品質(zhì)指標測定
肌肉系水力參照陳代文等的方法進行測定并作適當修改。取 5 g 左右的新鮮背部肌肉， 4 ℃ 懸掛貯存一段時間后( 保鮮肉) ，稱質(zhì)量，求出滴水損失。滴水損失的多少反映系水力( water-holding capacity) 大小。
滴水損失、蒸煮損失和含肉率等肉品質(zhì)相關(guān)指標的計算公式如下:
滴水損失 = ( 貯存前肉質(zhì)量－貯存后肉質(zhì)量) /貯存前肉質(zhì)量×100%，
蒸煮損失 = ( 蒸煮前肌肉質(zhì)量－蒸煮后肌肉質(zhì)量) /蒸煮前肌肉質(zhì)量×100%，
含肉率 = ( 魚體肉質(zhì)部分質(zhì)量 /魚體質(zhì)量) ×100%。
每個網(wǎng)箱隨機選取 4 條魚，剝?nèi)ケ臣〔糠制つw，用美能達色度計( CR－10， Minolta，日本) 測定肌肉肉色相關(guān)指標。
肌肉質(zhì)構(gòu)分析: 在采樣后 24 h 內(nèi)，每組選 4 尾魚，各取 1 cm3 背部肌肉，使用質(zhì)構(gòu)儀( TA． XT Plus，Stable Micro Systems，英格蘭) 與直徑為 50 mm 的鋁制壓縮板進行測定。用 Exponent 軟件( Stable Micro Systems Version 6．0) 記錄測定數(shù)據(jù)。考察參數(shù)主要包括硬度、黏附性、內(nèi)聚性、咀嚼性以及彈性等，參照Hixson 等的方法進行處理。
1．3．4 血漿生理生化指標測定
血液生化指標中的總蛋白和白蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒檢測。其中，總蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定，白蛋白含量采用溴甲酚綠比色法測定。補體C3 與 C4 含量和免疫球蛋白 M( IgM) 含量用 ELISA 法測定。血漿髓質(zhì)過氧化物酶( MPO) 和溶菌酶活性參照 Zhang 等的方法測定。皮質(zhì)醇含量參照陳群等的方法測定。
1．3．5 肝臟抗氧化性能測定
準確稱取適量肝臟組織，在冰浴條件下，按照組織與生理鹽水質(zhì)量體積比為 1 ∶9 的比例混合后進行勻漿，制成 10%( 體積分數(shù)) 的勻漿液，然后于 4 ℃、3 000 r·min－1 離心 10 min。取上清液用于超氧化物歧化酶( SOD) 、過氧化氫酶( CAT) 和谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px) 活性以及丙二醛( MDA) 含量和總抗氧化能力( T-AOC) 的測定。樣品上清液中的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍比色法測定。肝臟 SOD、CAT 和 GSH-Px 活性按照 Li 等的方法測定。MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定。T-AOC 參考鞠雪等的方法測定。
1．3．6 腸道消化酶活性測定
準確稱取適量腸道樣品，在冰浴條件下，按照組織與生理鹽水質(zhì)量體積比為 1 ∶9 的比例混合后進行勻漿，制成 10%的勻漿液，然后于 4 ℃、3 000 r·min－1離心 10 min。取上清液用于蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的測定。蛋白酶活性采用福林－酚法測定; 脂肪酶活性參照 Furne 等的方法測定; 淀粉酶活性采用碘－淀粉比色法測定; 各管腸道勻漿樣品中蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。
1．4 生長性能指標及其計算方法
魚體生長性能相關(guān)指標: 增重率( WG) 、特定生長率( SGR) 、飼料系數(shù)( FCR) 、蛋白效率比( PER) 、氮 /能量保留率( N /ERE) 、肥滿度( CF) 、肝體比( HSI) 、臟體比( VCI) 、腹脂率( IPF) 的計算公式如下:
WG= ( Wt － W0 ) /W0 × 100%; SGR = ( lnWt － lnW0 ) /T × 100%; FCR = F/( Wt － W0 ) ; PER = ( Wt － W0 ) / ( F×CP) ; N/ERE= ［( Wt×Ct ) －( W0 ×C0) ］ /( F×C) ×100%; CF = Wt /L3 ×100%; HSI = W肝 /Wt ×100%; VCI = W內(nèi)臟 /Wt×100%; IPF=W腹脂 /Wt×100%。
以上公式中: W0 為魚的初始體質(zhì)量( g) ; Wt 為試驗結(jié)束時魚的終末體質(zhì)量( g) ; L 為試驗結(jié)束時魚的體長( cm) ; T 為養(yǎng)殖時間( d) ; F 為攝食量( g) ; CP 為試驗飼料中的蛋白質(zhì)含量( %) ; C 為試驗飼料中的養(yǎng)分含量( %) ; C0 為魚體初始養(yǎng)分含量( %) ; Ct 為養(yǎng)殖結(jié)束后魚體的養(yǎng)分含量( %) ; W肝、W內(nèi)臟 和 W腹脂 分別表示肝臟、內(nèi)臟和腹脂質(zhì)量。
1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
采用 SPSS 20．0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析( one-way ANOVA) ，數(shù)據(jù)差異顯著時，采用Duncan's檢驗法進行多重比較，差異水平定為 0．05。試驗結(jié)果均保留 2 位小數(shù)，并以 x珋±SE 表示。
2 結(jié)果與分析
2．1 發(fā)酵飼料對鯉魚生長性能的影響
由表 2 可知: 各組飼料對鯉魚的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率、攝食量、蛋白效率比、氮保留率、能量保留率、肥滿度、肝體比、臟體比和腹脂率均無顯著影響( P＞0．05) ，但顯著影響飼料系數(shù)( P＜0．05) 。與G1 組相比， G3、G4、G5 組的飼料系數(shù)顯著降低， G2 組無顯著變化，而 G3、G4、G5 組間的飼料系數(shù)差異不顯著( P＞0．05) 。
2．2 發(fā)酵飼料對鯉魚體組成的影響
由表 3 可知: 各組飼料對鯉魚的水分、蛋白質(zhì)、灰分、脂肪含量和能量水平均無顯著影響( P＞0．05) 。
2．3 發(fā)酵飼料對鯉魚腸道消化酶活性的影響
由表 4 可知: 各組飼料對鯉魚的腸道蛋白酶活性無顯著影響。G4 組的脂肪酶活性最高，并顯著高于G1、G2 和 G5 組( P＜0．05) 。G1 組的淀粉酶活性最高，并顯著高于 G3 和 G5 組( P＜0．05) 。
2．4 發(fā)酵飼料對鯉魚肌肉品質(zhì)的影響
各組飼料對鯉魚的系水力、蒸煮損失、含肉率、硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性、黏附性以及肉色 a* 、b* 、L* 值均無顯著影響( P＞0．05) ( 表 5) 。
2．5 發(fā)酵飼料對鯉魚非特異性免疫機能的影響
各組飼料對鯉魚的血漿血糖水平、溶菌酶活性以及總蛋白、球蛋白和補體 C4 含量均無顯著影響( P＞0．05) 。各組 IgM 含量均無顯著差異( P＞0．05) 。對照組的血漿皮質(zhì)醇水平和補體 C3 含量均與 G2 組之間差異不顯著( P＞0．05) ，但卻顯著低于其他各組( P＜0．05) 。G1、G2 和 G3 組間的血漿髓質(zhì)過氧化物酶活性差異不顯著( P＞0．05) ，但均顯著高于 G4、G5 組( P＜0．05) ( 表 6) 。
2．6 發(fā)酵飼料對鯉魚肝臟抗氧化性能的影響
由表 7 可知: 各組飼料對鯉魚肝臟的 CAT、T-AOC、SOD 和 GSH-PX 活性以及 MDA 含量均無顯著影響( P＞0．05) 。
3 討論
為了貼近實際生產(chǎn)并更真實地反映發(fā)酵飼料的使用效果，本試驗在配置飼料時采用了 2 種方法，即直接添加和等蛋白替代。直接將發(fā)酵飼料添加至基礎(chǔ)飼料中的依據(jù)在于，在生產(chǎn)實踐中絕大多數(shù)企業(yè)的飼料配方較為固定，調(diào)整其飼料配方具有較大的難度，并會在一定程度上增加飼料生產(chǎn)成本。因此，考慮將發(fā)酵飼料作為一種微量的原料直接添加，具有較強的可操作性。將發(fā)酵飼料等蛋白替代基礎(chǔ)飼料中的菜粕的依據(jù)在于，發(fā)酵飼料的粗蛋白水平為 18%、水分為 42%，烘干后其蛋白水平與菜粕最為接近，用它替代菜粕，不僅能夠滿足與對照組等氮的需要，且對飼料配方的改動較小。
3．1 發(fā)酵飼料對鯉魚生長性能和肌肉品質(zhì)的影響
本試驗中，發(fā)酵飼料等蛋白替代 5%菜粕組顯著降低了鯉魚的飼料系數(shù)，且這組的攝食量比其他組低。這表明，這組鯉魚的飼料利用率較高，增長單位體質(zhì)量消耗的飼料量最少。使用這種飼料將顯著降低養(yǎng)殖成本。究其原因，一方面可能是經(jīng)過微生物發(fā)酵后，飼料中植物蛋白源中的抗營養(yǎng)因子含量顯著降低或者被消除; 同時，一部分大分子蛋白被降解成能夠被水產(chǎn)動物直接消化吸收的小分子蛋白、小肽和氨基酸。經(jīng)過上述過程，飼料的營養(yǎng)價值得以改善，進而提高了動物機體的利用率。另一方面，隨著發(fā)酵飼料添加或替代量的增加，飼料的酸度會發(fā)生變化，這在一定程度上會影響飼料的適口性，進而抑制動物的食欲，最終造成攝食量下降。此外，發(fā)酵飼料中的益生菌可以在動物機體腸道內(nèi)生長繁衍，促進腸道內(nèi)維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)成分的消化吸收，提高了飼料利用率進而改善了機體的生長性能。值得注意的是，發(fā)酵飼料等蛋白替代 5%菜粕組飼料的水分含量高于其他組，這也可能對結(jié)果造成一定影響。系水力是最重要的肉品質(zhì)指標之一，其大小經(jīng)常用滴水損失來描述，滴水損失越多表示系水力越小。滴水損失越低肉質(zhì)越好。此外，含肉率的高低也是評價魚類肌肉品質(zhì)、經(jīng)濟性狀和生產(chǎn)性能的重要指標之一。而肌肉的顏色( 肉色) 是肉品質(zhì)優(yōu)劣的外觀表現(xiàn)，是人們能夠看到、感覺到的最直觀的印象。質(zhì)構(gòu)能反映肉質(zhì)的軟硬程度和彈性，是肉品食用的主要指標。在本試驗中，發(fā)酵飼料對肌肉的系水力、蒸煮損失、含肉率、質(zhì)構(gòu)以及肉色均無顯著影響。究其原因，一方面可能是發(fā)酵飼料對各組魚體肌肉營養(yǎng)成分和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生顯著影響，從而未對肌肉品質(zhì)造成影響; 另一方面，可能是發(fā)酵飼料需要添加到一定量時才會對肌肉品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，而本試驗中發(fā)酵飼料的添加量較低，最高的只有10%，不足以造成顯著影響。這也表明，發(fā)酵飼料可以很好地被鯉魚利用，而不會對其肌肉品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。
3．2 發(fā)酵飼料對鯉魚消化酶活性的影響
研究表明，腸道是動物營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所。魚類( 尤其是無胃魚類) 主要靠消化酶進行化學性消化，因此腸道消化酶活性可以在一定程度上反映魚類的消化能力。本試驗中，腸道脂肪酶活性和淀粉酶活性以等蛋白替代 5% 菜粕組為最高，等蛋白替代 10% 菜粕組的脂肪酶和淀粉酶活性均較低，而各組間蛋白酶活性相差不大。這表明，發(fā)酵飼料可以在一定程度上提高鯉魚腸道消化酶活性，進而改善其消化機能，但過量的發(fā)酵飼料會影響腸道的消化功能。其原因可能是，飼料經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的有機酸、菌體活性蛋白、葉酸以及益生菌等物質(zhì)能有效改善動物的消化道微生態(tài)環(huán)境，促進消化酶分泌，且益生菌在增殖過程中會分泌一定的酶類，對內(nèi)源性酶進行一定補充，從而提高機體的腸道消化酶活性;也可能是，發(fā)酵飼料中抗營養(yǎng)因子的降低或消除，使原料營養(yǎng)成分迅速轉(zhuǎn)化，進而提高動物機體的消化吸收能力。但是，過量添加發(fā)酵飼料會引起腸道內(nèi)酸度過高，導致消化酶活性下降，進而對腸道消化吸收功能造成負面影響。
3．3 發(fā)酵飼料對鯉魚免疫機能及肝臟抗氧化能力的影響
本試驗中，發(fā)酵飼料等蛋白替代 5% 菜粕組的皮質(zhì)醇和補體 C3 含量均高于對照組，而髓質(zhì)過氧化物酶的活力則顯著低于對照組。這可能是發(fā)酵飼料和益生菌在一定程度上提高了鯉魚的非特異性免疫機能。這是因為，血液中血糖和皮質(zhì)醇水平升高，在一定程度上反映動物機體出現(xiàn)了輕微的應(yīng)激反應(yīng); 而補體 C3 含量提高，反映發(fā)酵飼料能刺激機體的非特異性免疫反應(yīng)，進而提高其免疫機能; 此外， MPO 活性與中性粒細胞的功能和活力密切相關(guān)，其活力下降反映組織細胞的應(yīng)激反應(yīng)減弱。究其原因，一方面可能是發(fā)酵飼料中的小分子蛋白、肽類和游離氨基酸含量相對較高，能夠在一定程度上增強機體的非特異性免疫力; 另一方面可能是發(fā)酵飼料中的益生菌能夠激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫來增強機體免疫機能。
細胞在代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，當其過量時會導致機體氧化損傷，如細胞膜完整性受損和DNA 結(jié)構(gòu)破壞等。同時，動物機體內(nèi)有一套防御系統(tǒng)，其由多種抗氧化酶和還原性物質(zhì)構(gòu)成。其中， GSH能夠與自由基結(jié)合， SOD 可以將 O·－2轉(zhuǎn)化為 H2O2，而 GSH-Px 在 GSH 的參與下，催化 H2O2 的分解，從而清除自由基。本試驗中，發(fā)酵飼料對鯉魚肝臟中的 SOD、CAT、GSH-Px、MDA 和 T-AOC 等均無顯著影響。這表明，在飼料中添加發(fā)酵飼料和益生菌沒有影響鯉魚的抗氧化能力。此試驗結(jié)果與王一娟等和徐奕晴等在中華絨螯蟹上的研究結(jié)果不一致。究其原因，一方面可能是益生菌和發(fā)酵飼料對動物機體抗氧化能力的調(diào)節(jié)作用存在種間特異性，且與蛋白源的替代水平及動物養(yǎng)殖周期的長短等因素密切相關(guān); 另一方面可能是本試驗中發(fā)酵飼料添加量相對較低，不足以影響機體的抗氧化功能。
本試驗結(jié)果表明，發(fā)酵飼料等蛋白替代 5%菜粕組的飼料系數(shù)較低、腸道消化酶活性較高且非特異性免疫機能較強，而其蛋白效率比及氮保留率均與對照組相差不大，表明這組飼料不僅可以提高魚體對飼料的利用率，還可以在一定程度上改善魚體的消化機能和免疫力。在實際生產(chǎn)中，使用這組飼料來飼喂鯉魚，將會在一定程度上降低飼料消耗量并改善魚體抗病力，進而降低養(yǎng)殖成本并改善養(yǎng)殖效益，也不會影響鯉魚的肌肉品質(zhì)。
參考文獻（略）。
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